藥品無(wú)菌檢查出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的原因復(fù)雜，主要和實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)用品、操作人員無(wú)菌操作規(guī)范程度及供試品真實(shí)的無(wú)菌水平等有關(guān)，本文重點(diǎn)闡述與出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果有關(guān)的諸多實(shí)驗(yàn)環(huán)境等因素，意在為微生物檢驗(yàn)人員作陽(yáng)性結(jié)果原因分析時(shí)提供參考。
一．相關(guān)因素
1．實(shí)驗(yàn)用器皿等相關(guān)因素：
實(shí)驗(yàn)用器皿、用具等因素可從包括藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量（無(wú)菌配制，非無(wú)菌配制）、培養(yǎng)器的無(wú)菌性能、培養(yǎng)基的無(wú)菌性等方面考慮。重點(diǎn)介紹藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量（無(wú)菌配制，非無(wú)菌配制）測(cè)試
2．實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素：
無(wú)菌檢查過(guò)程中的空氣沉降菌、 工作臺(tái)面的染菌量、無(wú)菌工作服染菌量。
3．實(shí)驗(yàn)人員因素：
操作人員雙手染菌量、不規(guī)范操作。
二．驗(yàn)證方法
1．無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)用器皿等
1.1首先應(yīng)目視檢查供試品、無(wú)菌培養(yǎng)器包裝有否開(kāi)裂、破損。發(fā)現(xiàn)包裝破損的不得使用；
1.2培養(yǎng)基包裝的塞子是否松動(dòng)，有松動(dòng)現(xiàn)象的應(yīng)不得使用；
1.3藥品外包裝的消毒有效性
藥品外包裝上的染菌量不容忽視，必須經(jīng)充分消毒后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)面。
藥品外包裝上的染菌量驗(yàn)證可采用下述方法進(jìn)行：
（1）取供試品外包裝未經(jīng)消毒直接置紫外燈下30分鐘后取樣。
（2）取供試品經(jīng)酒精棉球或消毒液浸泡一定時(shí)間，擦干后再暴露在紫外燈下30分鐘后取樣。
供試液制備：
取供試品3個(gè)包裝，分別用無(wú)菌鑷子夾住經(jīng)無(wú)菌氯化鈉溶液濕潤(rùn)的無(wú)菌棉球，擦拭一周，棉球置100ml無(wú)菌氯化鈉溶液，另取一塊無(wú)菌棉球重復(fù)擦拭一遍，制成供試液。供試液振搖1分鐘經(jīng)開(kāi)放式濾膜法過(guò)濾、取濾膜培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，得到的數(shù)據(jù)即可比較藥品外包裝2種消毒方法的消毒效果。
1.4酒精棉球等消毒劑的含菌量測(cè)試
酒精棉球等消毒劑的含菌量測(cè)試，可分別測(cè)試無(wú)菌配制及非無(wú)菌配制的消毒劑的含菌量，還需注意新鮮配制的與反復(fù)使用的消毒劑含菌量的變化。
測(cè)試方法可采用開(kāi)放式濾膜法過(guò)濾、取濾膜培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，得到的數(shù)據(jù)即可比較不同方法配制及不同時(shí)間使用的消毒劑的含菌量。
1.4.1無(wú)菌室常用消毒劑的配制：
無(wú)菌室使用的消毒劑應(yīng)在凈化臺(tái)面上配制，需過(guò)濾的應(yīng)準(zhǔn)備已滅菌的濾器。配好的消毒劑應(yīng)在盛放的瓶子上標(biāo)明名稱、配制日期、失效期等。
1.4.1.1 75％酒精棉球：
取95％的酒精，加注射用水制成75％的酒精溶液，取該溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后放入已滅菌的瓶中，備用。取經(jīng)121℃30分鐘滅菌的脫脂棉球，置無(wú)菌包裝內(nèi)，倒入75％的酒精溶液，即得。該酒精棉球在48h內(nèi)使用。如取成品消毒酒精配制的，脫脂棉球需經(jīng)121℃30分鐘滅菌。
1.4.1.2 0.1％新潔爾滅溶液的配制：
取注射用水，加入不同濃度的新潔爾滅溶液，使成0.1％濃度，并攪拌均勻，將配制好的溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后放入已滅菌的瓶中，備用。此溶液應(yīng)在48h內(nèi)使用。
2實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素 無(wú)菌檢查過(guò)程中的空氣沉降菌測(cè)試、 工作臺(tái)面的染菌量測(cè)試、無(wú)菌工作服染菌量測(cè)試
2.1無(wú)菌實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用10000級(jí)環(huán)境下置100級(jí)凈化臺(tái)或操作臺(tái)面的無(wú)菌室或無(wú)菌隔離器中進(jìn)行。無(wú)菌室的潔凈度測(cè)試可參照潔凈室潔凈度檢查的方法進(jìn)行并判定。
2.2無(wú)菌檢查過(guò)程中的無(wú)菌室環(huán)境監(jiān)測(cè)，可采用空氣沉降菌測(cè)試來(lái)完成。
2.3工作臺(tái)面的染菌量測(cè)試
取樣時(shí)間，按正常的程序消毒，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取樣。
供試液制備：取5×5cm的滅菌標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格板，放在凈化臺(tái)操作區(qū)表面，用浸有無(wú)菌氯化鈉溶液的棉拭子在規(guī)格板內(nèi)來(lái)回涂抹，棉拭子剪去手握部位后放入100ml無(wú)菌氯化鈉溶液中制成供試液，以同法操作采樣2個(gè)表面。振搖供試液，備用。供試液經(jīng)開(kāi)放式濾膜法過(guò)濾、 取濾膜培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，即可得到工作臺(tái)面的染菌量。
2.4無(wú)菌工作服染菌量測(cè)試
取樣時(shí)間 待操作人員實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用進(jìn)行。
接觸碟制備 取無(wú)菌平皿，緩緩澆注事先融化（低于40℃）的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基至滿皿（使成凝固后瓊脂表面略高于平皿邊緣）凝固后備用。
測(cè)試方法：取備妥的平板2塊，待操作人員實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別在其工作服的雙臂靠近手腕處，輕輕印壓取樣。培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。按企業(yè)制定的規(guī)定判定結(jié)果。
3．實(shí)驗(yàn)人員因素 （操作人員雙手染菌量測(cè)試、不規(guī)范操作）。
3.1操作人員雙手染菌量測(cè)試
取樣時(shí)間 實(shí)驗(yàn)人員按常規(guī)程序洗手、消毒，于無(wú)菌檢查操作結(jié)束后進(jìn)行。
供試液制備 取浸有無(wú)菌氯化鈉溶液的棉拭子沿著操作人員雙手的指跟朝指尖方向拭抹，
雙手分別拭抹食指到小指各4個(gè)指頭，棉拭子剪去手握部分，浸入100ml無(wú)菌氯化鈉溶液，
振搖供試液并經(jīng)開(kāi)放式濾膜法過(guò)濾、 取濾膜培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，即得操作人員雙手的染菌量。
也可取備妥的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，操作人員將雙手的五個(gè)手指分別在瓊脂表面
涂抹。平板置35℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，即得。
3.2不規(guī)范操作行為
在無(wú)菌室的硬件施設(shè)符合規(guī)定的情況下，要注意無(wú)菌操作不規(guī)范的行為，主要的有：
3.2.1超大量過(guò)濾供試液 有的單位將幾批藥品用一個(gè)濾器過(guò)濾（200瓶-400瓶），超大量過(guò)濾供試液造成的頻繁換瓶，會(huì)導(dǎo)致抽入大量空氣，引發(fā)供試液假陽(yáng)性結(jié)果。就是在正常檢查過(guò)程中，也要求關(guān)機(jī)換瓶，以防止抽入大量空氣，引發(fā)供試液假陽(yáng)性結(jié)果。
3.2.2違反操作規(guī)程，在供試品未溶解徹底的情況下過(guò)濾，造成堵膜使培養(yǎng)器杯內(nèi)壓力增加，培養(yǎng)器護(hù)帽反復(fù)彈出，破壞空氣濾膜的完整性。
3.2.3抽濾過(guò)程中泵速過(guò)快 特別在抽濾安瓶裝供試液時(shí)，集菌儀的泵速不能超過(guò)50轉(zhuǎn)，不然過(guò)快的泵速也會(huì)導(dǎo)致抽入大量空氣，導(dǎo)致供試品的假陽(yáng)性結(jié)果。
3.2.4消毒劑的配制與使用管理不規(guī)范引起的供試品假陽(yáng)性的案例并不少見(jiàn)。
3.2.5要重視藥品外包裝的消毒有效性，因藥品外包裝上污染的微生物可直接被引入到操作過(guò)程。
3.2.6培養(yǎng)基多劑量包裝，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反復(fù)抽取很有可能造成污染。
3.2.7要注意無(wú)菌衣的潔凈度，無(wú)菌衣在實(shí)施無(wú)菌操作前一定要經(jīng)過(guò)滅菌處理。
三．供試品出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果后的原因追溯方法
樣品無(wú)菌檢查出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，如操作的回顧性追溯及培養(yǎng)器、培養(yǎng)基的陰性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的沉降菌等常規(guī)生物監(jiān)控均無(wú)發(fā)現(xiàn)原因的，應(yīng)進(jìn)行污染菌的溯源調(diào)查。過(guò)程大致如下：
1.陽(yáng)性菌種分離、鑒定。
2。相關(guān)因素排查
2.1實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境空氣污染微生物
方法：浮懸菌采樣器采取無(wú)菌室空氣—空氣樣本中平板菌落形態(tài)與檢出陽(yáng)性菌比較—取形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽(yáng)性菌比較---一致的繼續(xù)按陽(yáng)性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。
2.2消毒液微生物污染
消毒液污染的微生物溯源比較復(fù)雜，污染微生物的來(lái)源有消毒劑本地帶入、使用者雙手、配制用水、盛放容器等，一一排查的可操作性不強(qiáng)，下面僅介紹與檢出陽(yáng)性菌相關(guān)的消毒液排查的方法
方法：
2.2.1菌種分離：陽(yáng)性檢出發(fā)現(xiàn)時(shí)原消毒液尚保留的，可取消毒液100ml，用開(kāi)放式過(guò)濾器過(guò)濾后，生理鹽水沖洗300ml，取下濾膜，貼在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，（視檢出的陽(yáng)性菌性質(zhì)選用培養(yǎng)基），厭氧或需氧培養(yǎng)。有菌落生長(zhǎng)的，平板菌落形態(tài)與撿品陽(yáng)性菌比較—取形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽(yáng)性菌比較---一致的繼續(xù)按陽(yáng)性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。
2.2.2陽(yáng)性檢出發(fā)現(xiàn)時(shí)原消毒液已廢棄，可取一定量的陽(yáng)性菌接種到無(wú)菌方法配制的原消毒液中，放置過(guò)夜，取一定量，經(jīng)開(kāi)放式過(guò)濾器過(guò)濾后，用生理鹽水沖洗300ml，取下濾膜，貼在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，計(jì)數(shù)回收微生物。如接種的微生物能回收到75％，那么撿品陽(yáng)性菌的污染源來(lái)自消毒液的可能性較大。
2.3生產(chǎn)環(huán)境排查
2.3.1到生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)采集空氣微生物，取菌落形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽(yáng)性菌比較---一致的繼續(xù)按陽(yáng)性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。
2.3.2陽(yáng)性檢出菌種與以往生產(chǎn)環(huán)境中收集的微生物比較，判斷。（企業(yè)必須自建菌種庫(kù)）